Современную биологию и медицину уже невозможно представить без получения генетически модифицированных животных и их клонирования. Для манипуляций с клетками используют микропипетки, химические реактивы, методы электрослияния клеток. Однако все эти технологии в той или иной степени травмируют клетку и снижают эффективность операции. В  Институте химической физики им. Н.Н. Семёнова  разработали уникальную щадящую технологию, которая позволяет манипулировать с эмбриональными клетками исключительно с помощью света, без механических устройств. Работа проводится в кооперации с учёными из Института теоретической и экспериментальной биофизики, Института молекулярной генетики. Института общей физики им. А.М. Прохорова, а также коллегами из бывшего СССР, которые в настоящее время работают в Центре молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка. Научно-исследовательском центре биофотоники и молекулярной визуализации.
Национального университета Ян Мин (Тайвань).

Рассказывает один из авторов исследования, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией ИФХ РАН Виктор Надточенко: « Наше основное достижение состоит в том, что мы объединили несколько фундаментальных физических методик для проведения достаточно сложных многостадийных операций так называемого терапевтического или репродуктивного клонирования млекопитающих с использованием только лазерного излучения».

Морула с перфорированной защитной оболочкой. Стрелка указывает место перфорации

Под оболочку морулы ввели эмбриональные клетки

Учёные использовали два ключевых инструмента: лазерный пинцет и лазерный скальпель. Лазерный пинцет представляет собой излучение титан-сапфирового непрерывного лазера с длиной волны 790 нм, сфокусированное объективом микроскопа. С его помощью можно захватывать, удерживать и перемещать биологические клетки или небольшие объекты весом в несколько пикограмм. Роль скальпеля выполняет фемтосекундный лазер, фокусировка излучения которого объективом микроскопа обеспечивает очень высокую плотность мощности при низкой энергии импульса. Такое излучение позволяет проводить сложные операции внутри клеток и эмбрионов с точностью до десятков нанометров, не повреждая при этом внешней оболочки эмбриона.

С помощью новой технологии исследователи получили химерные эмбрионы мыши, то есть эмбрионы, состоящие из генетически разнородных мышиных клеток. Когда оплодотворенная яйцеклетка приступает к делению, она образует плотное скопление клеток (морулу), окруженное защитной блестящей оболочкой. Затем морула превращается в бластоцисту – оболочку, состоящую из одного слоя клеток, и клеточной массой внутри. На этой стадии эмбрион разрывает блестящую оболочку, имплантируется в матку и вырастает в полноценный организм. Клетки оболочки в дальнейшем образуют плаценту, а из внутренней клеточной массы развивается плод. Из этой же массы при необходимости получают эмбриональные стволовые клетки.

Химеры необходимы для научных исследований, получения сельскохозяйственных животных с заданными свойствами. Для их получения лучше работать с эмбрионами на максимально ранней стадии развития, чтобы затем все клетки развивались синхронно. Однако игла для микроманипулирования относительно велика, требует места, и с её помощью можно работать только с эмбрионами на стадии бластоцисты. Лазерные технологии позволяют манипулировать с эмбрионами, состоящими всего из двух, четырех или восьми клеток. В своих экспериментах учёные использовали выросшие на питательной среде эмбриональные стволовые клетки мыши, содержащие ген зелёного флюоресцирующего белка. Эти клетки ввели в мышиные эмбрионы на стадии морулы. Придерживая морулу лазерным пинцетом, исследователи проделали лазерным скальпелем отверстие в блестящей оболочке и ввели под нее эмбриональные клетки. Иглой микроманипулятора туда пролезть почти невозможно. Затем эмбрионы развивались на питательной среде до стадии бластоцисты. Клетки, введенные в эмбрион, благополучно включились в общую программу развития и вошли в состав как клеточной массы, так и трофобласта – будущей плаценты. Пересадив химерные эмбрионы мышам, можно будет отобрать среди потомства животных с заданными свойствами. В ближайшее время исследователи планируют провести эти эксперименты. Кроме того, они разрабатывают технологию клонирования: удаляют лазерным скальпелем ядро из эмбриональной клетки, почти не затрагивая окружающую цитоплазму, и переносят в неё ядро из другой клетки. Пипеткой так бережно работать невозможно, потому что она большая.
Бластоциста выходит из защитной оболочки. Эмбриональные стволовые клетки отмечены зеленым цветом;

Преимущества лазерной нанохирургии заключаются в быстроте проведения операции (она занимает не более двух минут), её высокой точности и бережном обращении с клетками. Тончайший сфокусированный луч выжигает отверстие очень точно и практически не травмирует цитоплазму.

«Подобными разработками, но пока не лазерными технологиями, занимаются самые передовые университеты с многомиллионным финансированием. Мы не можем почивать на лаврах, но пока мы первые. Наши работы активно поддерживает директор ИХФ РАН академик Александр Александрович Берлин, мы также очень признательны за финансовую поддержку работ со стороны программ Президиума РАН, руководителями которых являются академики РАНСергей Николаевич Багаев и Сергей Михайлович Алдошин», – говорит Виктор Надточенко.